Remarque : pour faciliter la compréhension des élèves, nous appellerons "pyruvate" ou "acide pyruvique" le succinate de sodium.
Interprétation :
Les mitochondries interviennent lors de la respiration cellulaire. Le substrat qu'elles utilisent est l'anion pyruvate CH3-CO-COO- (base conjuguée de l'acide pyruvique CH3-CO-COOH).
Les mitochondries ne consomment pas directement le glucose. Celui-ci est oxydé dans le hyaloplasme par une succession de réactions en deux molécules d'acide pyruvique. L'ensemble de ce processus se nomme la glycolyse.
La glycolyse produit en outre deux molécules d'ATP et deux composés réduits R'H2.
Dans le matrice mitochondriale, un ensemble de réactions, appelé cycle de Krebs, permet l'oxydation totale du pyruvate.
Le cycle de Krebs donne lieu à la production d'ATP, de composés réduits R'H2 et du CO2 rejeté lors de la respiration.
Les composés réduits R'H2 vont ensuite être oxydés par les chaînes respiratoires situées sur les crêtes mitochondriales. Par une série d'oxydoréductions, les électrons sont transférés de proche en proche jusqu'à un accepteur final : le dioxygène qui est réduit pour former de l'eau.
Ce flux d'électrons permet indirectement la production d'une grande quantité d'ATP.
PROTOCOLE :
- Remplir le bécher avec 15 mL de suspension mitochondriale et lancer l'agitation.
- Plonger la sonde à oxygène dans la suspension mitochondriale.
- Lancer la mesure.
- A t = 90s, injecter 0.3 mL de solution de glucose.
- A t = 180s, injecter 0.3 mL de solution de pyruvate.
- Ajuster l'échelle de la courbe.
- Annoter la courbe et mettre un titre.
- Ranger le poste de travail.
Préparation de la suspension mitochondriale (d'après G. Grousset, lycée Lamartinière Duchère) :
1- Matériel :
- Un coeur de mouton, de porc ou de boeuf.
- Des ciseaux.
- Un broyeur (blender).
- Une balance électronique.
- Une centrifugeuse et des tubes à centrifuger.
- Béchers, erlenmeyers, pipettes et propipette.
- Glace.
- Milieu d'extraction des mitochondries.
- Solution de succinate de sodium à 20g/L.
- Solution de glucose à 20g/L.
- Système Exao
2- Préparation du milieu d'extraction :
- Préparer une solution de phosphate monopotassique (KH2PO4) à 9,08 g/L.
- Préparer une solution de phosphate dissodique (Na2HPO4, 12H2O) à 9.47 g/L.
- Mélanger 78 mL de solution de phosphate monopotassique avec 322 mL de solution de phosphate dissodique pour obtenir 400 mL de solution tampon à pH = 7,2.
- Ajouter 0.8 g de BSA (Sérum Albumine Bovine) et 45 g de mannitol.
3- Extraction des mitochondries :
L'extraction des mitochondries se faisant à froid, penser à mettre le matériel préalablement au congélateur ou dans le freezer du réfrigérateur.
- A l'aide de ciseaux forts, découper 100 g de coeur.
- Broyer les 100 g de coeur avec 60 mL de milieu d'extraction.
- Ajouter 200 mL de milieu d'extraction et broyer à nouveau.
- Répartir le broyat ainsi obtenu dans les tubes à centrifuger et centrifuger ceux-ci pendant 5 min à 5000 tours/min.
- Pipeter le surnageant et le conserver dans un erlenmeyer maintenu au frais (bac en polystyrène + glaçons).
- Avant la manipulation, oxygéner la suspension mitochondriale à l'aide d'un agitateur magnétique pendant au moins 5 min.
