Interprétation des résultats :
- De 0 s à 120 s, la suspension de chloroplaste est à l'obscurité : l'énergie lumineuse nécessaire à la phase photochimique de la photosynthèse étant absente,il n'y a pas oxydation des molécules d'eau, la concentration de dioxygène reste stable.
- De 120 s à 240 s, la suspension de chloroplaste est éclairée : l'énergie lumineuse nécessaire à la phase photochimique de la photosynthèseest présente. Cependant l'accepteur d'électron présent naturellement dans les chloroplastes étant absent, la chaîne réactionnelle conduisant à l'oxydation des molécules d'eau est bloquée, la concentration de dioxygène reste stable.
- De 240 s à 360 s, la suspension de chloroplaste est éclairée et le réactif de Hill (accepteur d'électron) est présent : la chaîne réactionnelle conduisant à l'oxydation des molécules d'eau est rétablie, la phase photochimique de la photosynthèse peut avoir lieu. L'énergie lumineuse est transformé en énergie chimique, l'accepteur d'électron est réduit par les électrons provenant des molécules d'eau. Il y a dégagement de dioxygène, la concentration de dioxygène augmente.
- De 360 s à 480 s, la suspension de chloroplaste est à l'obscurité et le réactif de Hill (accepteur d'électron) est présent : l'énergie lumineuse nécessaire à la phase photochimique de la photosynthèse étant absente,il n'y a pas oxydation des molécules d'eau, la concentration de dioxygène reste stable.
- De 480 s à 600 s, la suspension de chloroplaste est éclairée et le réactif de Hill (accepteur d'électron) est présent : la chaîne réactionnelle conduisant à l'oxydation des molécules d'eau est rétablie, la phase photochimique de la photosynthèse peut avoir lieu, la concentration de dioxygène augmente. Celle-ci pourrait continuer de croître jusqu'à épuisement du réactif de Hill.
Protocole :
- Remplir le bécher avec 20 mL de suspension de chloroplastes.
- Insérer la sonde à dioxygène dans la suspension de chloroplastes et lancer l'agitation (modérée).
- Lancer l'acquisition :
t = 0 s : Obscurité
t = 120 s : Lumière
t = 240 s : Injection de 1 mL de réactif de Hill (Hexaferricyanure de potassium)
t = 360 s : Obscurité
t = 480 s : Lumière
- Ajuster l'échelle du graphique.
- Annoter la courbe et mettre un titre au graphe.
- Ranger le poste de travail.
Matériel :
- Système EXAO + sonde à dioxygène
- Agitateur magnétique
- Lampe halogène
- Bécher
- Seringue ou pipette 20 mL
- Seringue 1 mL
Préparation de la suspension de chloroplaste (pour 10 groupes) :
Le bon déroulement de l'expérience dépend étroitement de la qualité du matériel végétal utilisé. On peut prélever des végétaux comme la mercuriale dans la nature (à éviter l'hiver quand les plantes végétent) ou bien en acheter dans le commerce comme l'épinard. Mais attention, il ne faut pas acheter de plantes conservées sous atmosphère modifié. Il faut choisir, autant que possible, un végétal bien vert et vigoureux.
1- Préparation de la solution d'extraction des chloroplastes :
Attention : L'extraction des chloroplastes se fait à froid : les solutions ainsi que le matériel doivent être refroidis avant utilisation. De plus, cette préparation, ne se conservant pas, doit être réalisée peu de temps avant l'expérience.
Il s'agit d'un tampon phosphate pH 6.5 + saccharose.
Il est nécessaire de préparer une solution "double concentration" à partir de laquelle nous préparerons aussi une solution "simple concetration".
Solution "double concentration" :
- Hydrogénophosphate disodique Na2HPO4, 12H2O à 0.2 mol/L soit 143.2 g/L
- Dihydrogénophosphate de potassium KH2PO4 à 0.2 mol/L soit 27.2 g/L
- Saccharose à 0.5 mol/L soit 342 g/L
- Préparer 200 mL de solution "simple concentration".
- Dans un mortier, broyer 160 g de végétal dans un peu de solution "simple concentration". Ajouter et mélanger le reste des 200 mL de solution "simple concentration".
- Filtrer sur de la gaze (on peut utiliser également une "charlotte") et du coton dans un erlenmeyer. Ne pas hésiter à presser le broyat pour écourter l'opération.
- Vérifier au microscope que les chloroplastes sont bien présents dans le filtrat.
- Répartir le filtrat dans des tubes de centrifugation (10 mL) et centrifuger pendant 5 min à 1500 g (2500 tours/min).
- Jeter l'essentiel du surnageant (garder environ 1mL).
- Ajouter 5 mL d'eau distillée (le choc osmotique fait éclater les chloroplastes et l'accepteur d'électron biologique présent se trouve ainsi très dilué, ce qui équivaut à sa disparition) et bien agiter le tube pour remettre le culot en suspension.
- Ajouter 5 mL de solution "double concentration" pour rétablir la presion osmotique de départ.
- Transvaser le contenu des tubes dans un erlenmeyer et conserver la suspension de chloroplastes ainsi préparée au frais.
- Mettre la suspension de chloroplaste à température ambiante environ 20 min avant l'expérimentation pour qu'elle se réchauffe un peu.
Préparation du réactif de Hill :
Le réactif de Hill est à préparer juste avant l'expérience.
- Hexaferricyanure de potassium K3[Fe(CN)6] à 0.2 mol/L soit 3.29 g/50ml
Principe :
La réaction mise au point par Hill a permis de comprendre que l’acte photosynthétique pouvait se décomposer en deux réactions : réaction biochimique d’incorporation du CO2 et réaction photochimique d’oxydation de l’eau. Le principe consiste à obtenir la deuxième réaction seule grâce à un accepteur artificiel d’électrons (ici de l'hexaferricyanure de potassium). Cette réaction se réalise sur une suspension de chloroplastes.
